Protein isolation

 

 

protein isolation은 세포를 lysis 시켜서 세포의 단백질만을 얻어내는 실험법이다.

 

보통 western blot, SDS page 등을 하기 위해 사용한다.

 

 

 

 

1. 6well plate 에서 media 를 suction 해준 뒤, PBS로 washing 해주고 다시 suction 해준다.

 

2. 클린벤치에서 꺼낸 다음 200ul protein lysis buffer 를 각 well 당 처리해 주고 6well plate를 ice 위에 올려준다.

 

3. 그 다음 cell scraper 를 이용해서 well에 붙어 있는 cell 들을 모아 주고, EP tube에 옮겨준다. (ice 위에 올려둔 상태는 유지)

 

4. 샘플을 30초간 votex 해주고 10분간 ice 위에 올려둔다. (3반복)

 

5(5번 항목은 protein assay 항목 참조). 그 동안 protein standard를 위한 serial dilution 을 준비한다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

예를 들어 각 튜브당 Sample a b c d e f 의 6개의 standard tube가 있다고 할 때

 

 

 

a 튜브에는 80ul BSA

b,c,d,e,f 튜브에는 40ul PBS를 넣어준다.

그 뒤 a 튜브에서 40ul 를 취해서 b튜브에 옮겨준 뒤 피펫팅 한다.

그 뒤 b 튜브에서 40ul 를 취해서 c 튜브에 옮겨준 뒤 피펫팅 한다.

그 뒤 c 튜브에서 40ul 를 취해서 d 튜브에 옮겨준 뒤 피펫팅 한다.

그 뒤 d 튜브에서 40ul 를 취해서 e 튜브에 옮겨준 뒤 피펫팅 한다.

f 튜브에는 40ul 의 PBS만 넣어준다.

 

(40ul 하는 이유는 96well plate에서 3반복 하기위해서는 최소 30ul가 필요하므로)

 

 

6. 15000rpm 15min 4도에서 centrifuge 해준다.

 

7. 상층액을 취해서 새로운 EP tube에 옮겨준다.

(나머지 불순물 들은 EP tube 바닥에 뿌옇게 붙어있음)

 

8 Protein assay 실행, 혹은 deepfreezer에 보관한다.