Westurn blot protocol (수정중)
Western blot은 글로만으로는 설명이 어려우므로 곧 사진과 함께 수정할 계획임
1. Western set 준비 (1.5mm glass)
2. 10% gel solution 을 만들고 틀에 부어준다
3. isopropanol을 gel solution 위에 부어준다.
4. gel 이 굳으면 isopropanol을 버려주고 stacking gel solution 을 부어준뒤 1.5mm 에 맞는 콤브를 꼽아준다.
5. 다 굳으면 전기영동 set에 넣고 미리 준비해둔 protein sample(35ul) 을 넣어준다, 마커는 5ul
6. 80v 에서 10분, 100v에서 protein이 전부 내려갈 때 까지 전기영동 해준다 (E-buffer 사용)
7. gel 을 필요한 부분만 잘라둔다
8. transfer 작업시작, 솜, membrane filter, gel, membrane, membrane filter, 솜 순으로 쌓고 잘 닫아준다.
9. transfer 시작, T-buffer 채우고 90v에서 전기영동 (2시간)
10. membrane을 집개로 잡고 ponceau에 담가서 단백질 확인 그 후 원하느 kDa 에 맞게 커팅 후 TBST로 washing
11. 5% Skim milk로 2시간 블로킹 -> 냉장고 안에서 overnight (4도)
12. TBST 로 10분 간격으로 3번 washing 한 뒤 2% skim milk 1차 항체 처리(2시간~)
13. TBST 로 10분 간격으로 3번 washing 한 뒤 2% skim milk 2차 항체 처리 (2시간~)