RNA isolation

RNA isolation 프로토콜

 

75% Ethanol 50mL , 얼음 , Chloroform , isopropane , PBS , EPtube (effendorf tube) , Cell scraper , Trizol (Cat NO . 15506 - 91)

 

 

 

1. 클린벤치에서 6well에서 media를 석션하고 well 당 PBS 2mL를 사용해서 washing한다.

 

2. PBS 석션하고 얼음에 넣는다.

 

3. Trizol 500 ㎕ 씩 각 well에 넣어준다. ( 세포벽 분해 )

 

4. Cell scraper 이용해서 cell 모으고 EPtube에 넣어준다.

 

5. 각 튜브 당 Chloroform 200 ㎕ 씩 넣어준다.

 

6. 30초간 Votexing, 5분간 얼음에 보관.

 

7. 원심분리 15000 RPM , 4 °C에서 15분간 Running.

 

8. 상층액 RNA만 피펫팅해서 얻는다.

 

9. Isopropanol을 RNA 상층액을 얻은 양 만큼 넣어준다

 

10. Vortexing 30초 -> 5분 동안 얼음에 보관

 

11. 원심분리 15000 RPM 4 °C에서 10분간 Running 후 분리된 Isopropanol을 쏟아낸 후 75% EtOH을 1mL 넣어주고 Washing （원심분리 후 RNA가 바닥에 모임)

12. 원심분리 15000 RPM 4 °C에서 10분간 Running 후 다 쏟아낸 후 클린벤치에 넣고 5분동안 넣어놓는다. ( 더 오래 넣어도 됨)

 

13. DEPC 20mL 넣고 섞어준다.

14. -80도 에서 Deep freezer에 냉동 보관.