세포용 배지(DMEM FBS 10% Media) 만들기, cell counting 의 방법 및 원리

목차

 

1.실험목적 및 실험도구,재료

 

 

2.DMEM FBS 10% Media 만드는 방법 및 원리

 

 

3.Cell Thawing 및 Cell Counting 방법 및 원리

 

 

4.실험결과 및 고찰

 

 

 

 

 

 

 

실험목적 및 실험도구,재료

 

 

 

실험목적 : 동물이나 식물의 조직, 기관, 세포 또는 미생물 세포를 유리용기, 배양조 내에서 영양분을 주어 생육, 증식 시키는 것을 ‘조직배양’ 이라고 하는데, 그 중에서 세포를 생육, 증식시키는 방법을 ‘세포 배양’, 영어로 Cell culture라고 한다.

이 실험에서는 Cell culture를 하기 위한 전 단계(Media 만들기, Cell Thawing 과 Cell Counting)의 방법을 익히고 그 원리를 안다.

 

 

 

 

 

실험도구 및 재료 : Media Powder (DMEM: Dulbeco's Modified Eagle's Medium) , Destiled Water(DW) , Sodium bicarbonate , HCl (1N) , Stirrer , pH Meter , Media Filter , FBS (Fetal Bovine Serum) , Penicillin/Streptomycin , 60° Dish , Pipet , Tip , Water Bath , Centrifuge , PBS (Phosphate Buffered Saline) , Trypsin.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

DMEM FBS 10% Media (275ml) 만드는 방법 및 원리

1. 222.5ml 의 DW를 비커에 부어준다.

 

2. 3.37g의 DMEM Powder를 DW가 들어있는 비커에 넣어준다.

 

3. Stirrer를 이용해서 Mix 해준다.

 

4. pH Meter를 pH buffer를 이용해서 정확한 값이 나오는지 확인한다.

 

 

 

 

5. 0.925g Sodium bicarbonate를 넣어준다.

 

 

6. pH를 확인하면서 pH 가 7.2가 될 때 까지 Pipet 과 블루팁을 이용하여 HCl을 넣어준다.

 

7. 만들어진 DMEM Media를 Media bottle에 담아준다.

 

 

 

 

 

8. 그 후 클린벤치로 이동하여 무균 상태에서 Media filtering을 한다.

(Suction 기계를 이용하여 더 빠르게 필터링 할 수 있다.)

 

 

9. 25mL FBS 와 2.5mL Penicillin/Streptomycin을 넣어준다.

 

10. 60° Dish와 Media bottle 에 라벨링한다. (이름, 날짜, Media 이름)

 

 

 

 

 

 

11. 60° Dish에 Media를 3mL 정도 넣어준 뒤 하루동안 인큐베이터 안에서 배양한다, 그 후 현미경을 통하여 미생물 유무를 확인한다.(Media Test)

 

<완성된 Media>

 

DMEM FBS 10% Media (275mL) 만드는 원리

 

 

 

Media는 ‘배지’ 라고도 불리며, Cell 들이 자라기 위한 영양물질이 들어가

 

있다. 또한 FBS는 세포 및 조직배양에서 많이 사용되는 혈청으로. 이 혈청

 

은 포유류나 조류 외에도 곤충의 세포배양시 합성배지에 첨가하여 사용한다.

 

γ글로불린은 포함하지 않고, 세균·바이러스·리케차·원충에 대한 연구, 특히

 

면역학에 관여하는 조직배양을 위한 배지성분으로 많이 쓰이고 있다.

 

또한 세포들이 자라기 위한 호르몬이나 성장요소들을 포함하고 있다. 그리고

 

이 영양분들은 세포의 성장만을 위해 쓰이는 것으로 박테리아나 기타 미생

 

물들에 의해 오염될 경우, 세포에 쓰여야 할 영양분들을 뺏기게 되므로 기본

 

적인 미생물들을 죽이기 위해 페니실린/스트렙토마이신을 넣어주게 된다.

 

다만 페니실린/스트렙토마이신으로 제거 가능한 미생물들은 아주 기본적인

 

것이므로, 우선 오염이 되지 않게 주의하는 것이 우선시 돼야 한다.

 

 

 

 

 

 

 

Cell Thawing 및 Cell Counting 방법 및 원리

 

1. 질소탱크에서 Cell vial (1mL)를 꺼내고 Water Bath를 이용해서 해동한다.

 

2. 15mL Tube에 Media 7mL와 Cell을 넣는다.

 

3. 원심분리 1500RPM, 20℃에서 300초간 처리한다.

(이 때 원심분리 시 동일한 부피의 용액을 가진 Tube를 반대 방향에 넣는다)

 

4. 3번 처리한 Tube를 Suction하여 Cell만 남긴다.

 

5. 블루팁과 Pipet을 이용하여 Media (9mL)를 넣고 피펫팅 해준 뒤 Dish (10mL)에 옮긴다.

 

6. 그 후 배양하여 PBS , Trypsin 처리 해야하지만 , Thawing 직후 이므로 생략.

 

7. Hemocytometer에 10㎕ 만큼 넣고 Cell counting 한다.

 

*Cell Counting의 원리

 

4개의 면에 있는 Cell 들의 수를 센 뒤 4개로 나누어 평균을 구하고

Hemocytometer의 1mm² 한 칸의 volume은 0.0001ml(가로 x 세로 x 높이 : 0.1cm x 0.1 cm x 0.01cm = 0.0001cm³ = 0.0001ml)이므로 count한 cell 수의 계산은 sample 1ml당 1mm²한 칸에 든 평균 cell 수에 10⁴를 곱한 수만큼 cell이 있다고 생각하면 된다.

예를 들어, count한 cell의 수가 116인 경우, sample 1ml안에는 116 x 10⁴= 1.16 x 10^6개만큼의 cell이 있다고 계산하게 된다.

만약 필요한 Cell의 수가 5 x 10^4 이라면 5 x 10^4 : x = 1.16 x 10^6 : 1ml 같이 비례식으로 간단히 계산 할 수 있다.

 

실험결과 및 고찰

 

Media를 만들 때 원래는 1L 기준으로 미디어 파우더를 Chemical Balance로 측정하지 않고 하는데, 이번에는 250mL를 만들기 때문에 그 과정을 거치게 되었다. 이 때 오염되는 것을 우려했는데 걱정과 달리 Media Test 결과, 오염없이 잘 완성되었다.

 

Cell Thawing 및 Cell Counting 은 Media 만들기와는 달리 과정이 비교적 간단해서 익히는데 어려움이 없었다고 생각한다. 다만 Cell Counting 은 수학적 능력이 필요해서 일부 이해가 어려운 사람이 생길 수 도 있을 것 같다고 생각했다.

 

 

 

 

이미지와 함께인 보고서는 파일 첨부

 

 세포생.hwp