protein assay 기본상식

Protein assay

 

 

1. 단백질 정량이란 cell 등에서 protein isolation을 통해서 얻어낸 샘플의 단백질의 양 또는 농도를 구하는 과정으로 western bloting 등을 수행하기 위한 생물,화학적 기초작업이라고 할 수 있다 . 단백질 정량은 기초적인 작업이지만, 가장 중요한 작업(물론 모든 작업 중 하나라도 잘못되면 안되지만..)이라고 할 수 있다. 정량을 잘못하면 항체를 이용한 단백질 발현량 체크 등과 같은 실험을 할 때 잘못된 data를 얻기 때문이다. 특히나 western blot 같은 경우는 시간과 노력이 많이 드는 만큼 단백질 정량과정에서 오류가 생겼다면 ....크흠.. .흡광도를 이용하여 단백질을 정량하는 원리는 Beer-Lambert의 법칙에 따른 것이다. 용액에 의한 광의 흡수는 용질농도의 함수라고 하는 법칙인데,  다른 모든 조건을 변하지 않게 하고 흡광도를 측정하면 농도를 간접적으로 구할 수 있다는 것이다.(물론 피펫팅이 미숙하거나 하면 다른 모든 조건이 동일 할 수 없다, 그 차이를 최대한 줄이는 것이 중요). 미지농도 용액의 농도를 구하기 위해서는 이미 농도를 알고 있는 용액(standard)의 흡광도를 측정하여 standard curve를 구한 후 미지농도 용액의 흡광도를 측정해서 얻어진 숫자 값으로 농도를 추측한다.

 

 

2. 이 블로그에서 사용하는 단백질 정량법은 Bradford assay에 기초한다, 세포내의 pH에서 PAB(protein assay buffer)는 전하를 띠게 되는데, protein의 아미노산도 전하를 띠고 있어서 서로 결합하게 된다. 결합하게 되면 용액의 색깔이 갈색에서 푸른색으로 바뀌게 되며, 단백질 함량이 높을 수록 더 진한 파란색을 띈다. 단백질과 결합한 PAB의 양이 증가할수록 진한 파란색이 되기 때문에 이 원리로 단백질의 양을 측정할 수 있다.

 

			EX

 

	A	B	C	D	E	F
	1.2949	0.9306	0.6363	0.4976	0.4066	0.3723
	1.3285	0.9152	0.566	0.4999	0.4064	0.3835
	1.2964	0.7141	0.6427	0.4742	0.3875	0.4242
x	1.49	0.745	0.373	0.186	0.093	0
y	1.3066	0.8533	0.615	0.490567	0.400167	0.393333

 

 

 

 

 

 

x 값은 BSA의 농도로, 1.49mg/ml 의 농도를 가지고 있고, 1/2 씩 희석 했으므로 이론적으로 A->E까지 1.49에서 1/2씩 감소하게 됨을 나타낸다.

y값은 실제로 수행한 dilution 값으로, 595nm 파장 아래서 저 정도의 수치의 흡광도를 나타냈다는 것을 보여준다.

 

 

이를 standard curve로 변환하여 나타내면

 

 

 

 

 

와 같이 나타나게 된다. 이 때, R^2 값이 1에 가까울 수록 선형에 가까운 건데, 이 수치가 1에 가까울수록 좋다.

 

위 그래프를 이용하여 y=0.6295x+0.3736 이라는 공식을 구해냈으니 이를 이용하여 미지농도 단백질 용액을 정량해보자.

 

 

아래는 미지농도 단백질 용액 표이다.

	1	2	3	4	5	6
	0.728	0.7512	0.8239	0.6563	0.6592	0.6739
	0.6906	0.7351	0.7921	0.7792	0.6448	0.6612
	0.7639	0.7018	0.8497	0.7268	0.7061	0.596
평균	0.7275	0.729367	0.8219	0.720767	0.670033	0.6437
단백질 농도	0.562192	0.565158	0.712153	0.551496	0.470903	0.429071

 

 

단백질 농도는 식을 이용하여 (y-0.3736)/0.6295x 를 이용하여 구하면 된다

 

예를들어 (0.7275-0.3736)/0.6295=x  -> x= 0.562192.. 가 나오게 된다.

 

 

 

이를 이용하여 단백질을 25ug으로 정량해보면

 

sample	conc(ug/ul)	protein(25ug)	lysis buffer	loading dye	total
1	0.56	44.47	12.53	19	76
2	0.57	44.24	12.76	19	76
3	0.71	35.10	21.90	19	76
4	0.55	45.33	11.67	19	76
5	0.47	53.09	3.91	19	76
6	0.429	58.27	-1.27	19	76

 

이 떄, 6번 샘플의 lysis buffer 값에서 - 값이 나오게 됐는데, 이 경우 이 샘플은 사용 할 수 없게된다.

 

물론 정량 값을 20ug 정도로 내리면 한번 정도 쓸 양은 나올지도 모르겠다.

 

위의 예시에서 단백질 농도가 0.56 정도가 나오는데 이 정도면 매우 적은 양이다.

 

보통 2 정도 나오면 western 여러번 하기에 충분한 양이 나온다.

 

(본 표는 western 2번 분량(70ul) 기준으로 정량한 표이며, 76ul 인 이유는 역시 여분의 용량을 준비한 것이다)