실험 프로토콜/RT-RCR 썸네일형 리스트형 Tm 값 계산 하는 법 Tm 값이란 프라이머와 대상 DNA의 결합이 50% 가 되는 값을 말하는데, 이 Tm 값을 구하는 계산에는 여러 변수가 있지만 가장 간단히 A T G C 를 이용해서 근사 값을 구하는 방법은 아래와 같다. Tm = (4×[G+C]) + (2×[A+T])℃ Tm 값을 너무 낮게 잡으면 증폭이 잘 되지 않아 데이터를 구하기 어렵고 Tm 값을 너무 높게 잡으면 다중 밴드가 나올 수 있기 때문에 적정한 Tm 값을 구하는 것이 관건이다. 보통 PCR 은 45~60 도 이내에서 해결하도록 되어 있고, 두개의 프라이머 (Reverse , Forward) 의 Tm 값이 서로 비슷 할 수록 더 좋은 결과를 내게 된다. (* 또한 두 프라이머의 GC 함량이 50%에 가깝게 하는게 좋다) Tm 온도보다 낮은 1-5도 낮게 .. 더보기 PCR 기본상식2 PCR 기본상식2 캐리 멀리스(Kary B. Mullis)에 의하여 1985년에 개발된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사법으로, 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법이다. 중합효소 연쇄 반응에 의해, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있으므로, 인간의 DNA를 증폭하여 여러 종류의 유전질환을 진단하는 데 사용된다. 또한 세균이나 바이러스, 진균의 DNA에 적용하여 감염성 질환의 진단 등에 사용할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응의 순서는 3단계로 이루어진다. 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하는 열변성 과정(denaturation)을 .. 더보기 EtBr 과 PCR gel EtBr 과 PCR gel EtBr(Ethidium Bromide)는 자외선(UV)를 받으면 가시광선으로 파장을 변화시키는 형광물질로써, 푸른 빛 계통의 짧은 파장을 파장이 긴 붉은 빛으로 바꾸어 방출시킨다. 또 EtBR은 단일가닥 또는 이중나선 구조를 가진 DNA에 부착되는 성질이 있다. DNA에 붙어 있을 때 형광능력이 향상되서 자외선을 쬐었을 때, 그냥 있었을 때 보다 더 밝게 빛나게 된다. 254nm 정도의 파장인 UV가 DNA에 부딪힐 때 300~370nm 의 파장으로 반사되게 되는데, 이 빛을 EtBr에 흡수 된 다음 590nm의 가시광선으로 바뀌게 된다. EtBr은 전기영동 종료 후 넣기도 하고 전기영동 전 Gel 을 만들 때 미리 넣어주기도 한다. EtBr을 미리 넣는 법과 끝난 뒤 넣는 .. 더보기 RT-PCR 기본상식 RT-PCR 기본상식 생명체는 환경 변화에 적응하고 자신을 유지하기 위한 단백질을 만들기 위해 중심원리(Central dogma) 라는 방식을 이용하게 되는데. 그 방식을 간략하게 살펴보면 생명체의 유전정보를 가지고 있는 DNA를 다음세대로 전달하기 위한 복제(replication) 과정과, DNA가 가지고 있는 정보를 바탕으로 이 정보를 밖으로 전달하기 위해 RNA를 만드는 전사(Transcription), RNA가 가지고 있는 정보를 바탕으로 단백질을 만들어내는(Translation)이 있다. 위와 같이, 정상적인 생명체라면 DNA -> RNA -> 단백질의 순으로 생체분자를 합성하는데. RT-PCR은 RNA -> DNA를 만들어서 만들어진 이 DNA를 증폭시키는 일련의 과정이다. 유전자의 변화를 이.. 더보기 cDNA 만들기 *이전의 프로토콜은 RNA isolation 항목 참조 1. Nano drop 기계를 이용하여 분리해낸 RNA의 순도 및 함량을 측정한다. (아래 표는 나노드랍 시행 시 예시) A Abs Value Abs Value 260 2.645 OD 2116 ng/µl 260 2.5560001 OD 2044.8 ng/µl 280 1.4524 OD 1.82 ratio 280 1.4047 OD 1.82 ratio B Abs Value Abs Value 260 2.4766 OD 1981.28 ng/µl 260 OD ng/µl 280 1.3828 OD 1.79 ratio 280 OD ratio C Abs Value Abs Value 260 3.3081 OD 2646.48 ng/µl 260 OD ng/µl 280 3.395.. 더보기 이전 1 다음
