cDNA 만들기

 

 

 

*이전의 프로토콜은 RNA isolation 항목 참조

 

1. Nano drop 기계를 이용하여 분리해낸 RNA의 순도 및 함량을 측정한다.

 

(아래 표는 나노드랍 시행 시 예시)

 

A		Abs		Value			Abs		Value
	260	2.645	OD	2116	ng/µl	260	2.5560001	OD	2044.8	ng/µl
	280	1.4524	OD	1.82	ratio	280	1.4047	OD	1.82	ratio
B		Abs		Value			Abs		Value
	260	2.4766	OD	1981.28	ng/µl	260		OD		ng/µl
	280	1.3828	OD	1.79	ratio	280		OD		ratio
C		Abs		Value			Abs		Value
	260	3.3081	OD	2646.48	ng/µl	260		OD		ng/µl
	280	3.3951	OD	0.97	ratio	280		OD		ratio
D		Abs		Value			Abs		Value
	260	2.0576	OD	1646.08	ng/µl	260		OD		ng/µl
	280	1.1245	OD	1.83	ratio	280		OD		ratio

 

A 샘플의 경우 2번의 분석을 했으며 2116ng/ul 2044.8ng/ul 가 각각 나왔으므로 이의 평균 값을 구한다.

 

 

2. 구해진 식을 가지고 RNA를 정량하여 모두 같은 수준으로 맞추어준다,

 

	ng/ul	ug/ul	1ug	depc
A	2116	2.116	0.47	11.03
B	1981.28	1.98128	0.50	11.00
C	2646.48	2.64648	0.38	11.12
D	1646.08	1.64608	0.61	10.89

 

위의 표는 단순히 예시를 참고하여 작성한 정량 표이다.

 

본인이 사용하는 프로토콜에선 1ug으로 졍량된 11.5ul 의 정량된 RNA solution 이 필요하므로

 

depc = 11.5 - 1/x    이때 x는 ug/ul의 역수

 

로 계산하면, A의 경우 0.47ul의 RNA solution과 11.03ul의 depc를 혼합하면 총 11.5ul의 1ug으로 정량 된 RNA solution이 된다.

 

 

3. RT1 (65도 16분 1cycle) 을 돌린다

 

4.

(마스터 믹스) - RT1 처리 끝난 각 튜브당 8.5㎕ 를 넣어서 총 20㎕를 만들어준다, 샘플이 6개인 경우 x6 이지만 여분을 위해 x7 해준다,

 

5X RT buffer - 4㎕

 

Reverse Transcriptase - 1㎕

 

dNTP mix - 2㎕

 

RNAse inhibitor - 0.5㎕

 

Random Hexamer Primer - 1㎕

----------------------------

8.5㎕

 

 

샘플 만들기가 완료 되었다면 RT2 (37도 60분 1cycle)를 돌려준다,

 

5. 만들어진 cDNA는 -20도 냉동고에 보관한다.