RT-PCR 기본상식

생명체는 환경 변화에 적응하고 자신을 유지하기 위한 단백질을 만들기 위해 중심원리(Central dogma) 라는 방식을 이용하게 되는데. 그 방식을 간략하게 살펴보면 생명체의 유전정보를 가지고 있는 DNA를 다음세대로 전달하기 위한 복제(replication) 과정과, DNA가 가지고 있는 정보를 바탕으로 이 정보를 밖으로 전달하기 위해 RNA를 만드는 전사(Transcription), RNA가 가지고 있는 정보를 바탕으로 단백질을 만들어내는(Translation)이 있다.

위와 같이, 정상적인 생명체라면 DNA -> RNA -> 단백질의 순으로 생체분자를 합성하는데. RT-PCR은 RNA -> DNA를 만들어서 만들어진 이 DNA를 증폭시키는 일련의 과정이다.

유전자의 변화를 이용하는 실험이라면, 환경이나 특정조건에 따라 세포내에서 그 양이 변하는 RNA를 주 실험 대상으로 삼는데. RNA는 DNA보다 불안정한 물질이면서 RNA 상태에서는 자체적으로 이 가닥을 증폭시킬 수 없기 때문에 보다 안정적이면서 자체적으로 증폭이 가능한 DNA로 변환시키게 된다.

이 과정을 역전사(Reverstranscription, RT) 라고 부르며, 이 과정을 통해 만들어진 DNA가 바로 cDNA(complementary DNA)라고 부르며 이를 이용한 PCR을 RT-PCR 이라고 부르는 것이다.

이 때, 이 유전자 가닥들을 복제하는 효소들은 크게 4가지로 나뉘는데, DNA를 주형으로 DNA를 복제하는 DNA polymerase, DNA를 주형으로 RNA를 합성하는 RNA polymerase, RNA를 주형으로 RNA를 합성하는 RNA replicase, RNA를 주형으로 DNA를 합성하는 RNA-dependent DNA polymerase 혹은 Reverse transcriptase라고 불리는 효소들이다.

역전사에 사용되는 Reverse transcriptase는 HIV와 같은 RNA 바이러스에서 발견되었다. RNA를 유전체로 갖는 이 바이러스는 증식할 때 역전사 효소를 이용해서 감염시킨 세포로 DNA를 전이 시켜야 하기 떄문에 역전사 효소인 Reverse transcriptase 가 필요하다.

(일반적인 생물체는 DNA를 유전체로 가지기 때문에 DNA -> RNA 과정을 거치기 떄문에 역전사 효소를 가지고 있지 않다.)

Reverse transcriptase를 이용한 RT-PCR은 cDNA의 합성을 하면서 동시에 PCR 반응까지 한 tube에서 일어나게 하는 One-step RT-PCR 과 cDNA 합성과 PCR 반응을 따로 진행하는 Two-step RT PCR 로 나눌 수 있다.

Two-step RT-PCR 은 한 RNA 샘플에서 여러 종류의 유전자를 증폭 할 때 좋은 방법으로 One-step RT-PCR보다 정확도가 높다고 할 수 있다.

하지만 각 유전자 샘플마다 일일히 작업을 시행해야 하기 때문에 많은 시간이 들어간다.

One-step RT-PCR의 경우 신속한 측정이 필요한 실험에서 많이 쓰인다.(병원 등등..)

위에서 설명한 PCR 방법으로 우리는 DNA를 수백만배로 불릴 수 있게 되었다,

그런데 위와 같은 방법으로 PCR을 시행할 때는 반응온도를 90℃ 까지 올리게 되는데, 대부분의 단백질들은 70℃ 만 넘어가도 단백질이 변성이 되어 제 역할을 하지 못하게 된다.

그래서 90℃로 올렸다가 37℃로 내리는 1cycle 마다 DNA 중합효소를 새로 넣어 주어야 했다.

그런데 이 방법은 37℃로 내릴 때 마다 만들어진 DNA가 서로 붙어버리는 일이 발생해서 전혀 사용할 수 없는 방법이었다...

적어도 Taq polymerase를 발견하기 전 까지는 말이다.

일본인 미생물 학자 사이키는 온천에 사는 세균의 단백질 중에서 DNA를 합성하는 단백질을 분리해냈다. 즉 높은 온도에서도 기능을 잘 발휘하는 DNA 중합효소를 찾은 것이다.

그것은 바로 온천에서 살고 있다는 뜻으로 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)라 불리는Taq DNA 중합효소였다. Taq DNA 중합효소의 최초 보고는 1969년 미국의 미생물학자 토머스 브록에 의해서였지만, Taq DNA 중합효소를 이용한 PCR기술을 완성한 것은 이때부터였다.