PCR 기본상식2

PCR 기본상식2

 

 

캐리 멀리스(Kary B. Mullis)에 의하여 1985년에 개발된 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사법으로, 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법이다. 중합효소 연쇄 반응에 의해, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있으므로, 인간의 DNA를 증폭하여 여러 종류의 유전질환을 진단하는 데 사용된다. 또한 세균이나 바이러스, 진균의 DNA에 적용하여 감염성 질환의 진단 등에 사용할 수 있다.

중합효소 연쇄 반응의 순서는 3단계로 이루어진다. 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하는 열변성 과정(denaturation)을 거친 후, 온도를 낮추어 시발체(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)하게 하고, 다시 열을 약간 올려서 DNA를 합성하는 중합 반응(polymerization or extension)을 일으킨다. 열변성 과정은 보통 95℃에서 열을 이용하여 2가닥의 DNA의 상보적인 염기의 수소결합을 1가닥으로 떨어뜨리는 과정이며, 결합 반응은 약 55~65℃에서 한 가닥의 DNA에 시발체가 상보적인 염기서열에 결합하는 과정이다. 마지막으로 중합 반응은 한 가닥의 DNA(주형 DNA)에 시발체가 붙은 다음의 염기에 DNA 중합효소(polymerase)를 이용하여 주형 DNA의 상보적인 염기를 합성하여 두 가닥의 DNA으로 연장시킨다. 그 후 다시 열변성 과정, 결합 반응, 중합 반응을 반복하여 DNA를 증폭하게 된다. 중합효소 연쇄 반응 1회를 시행하면 유전 물질은 2배로 증폭된다. 따라서 반응의 반복에 의한 기하급수적인 증폭이 가능하고, 중합효소 연쇄 반응을 n회를 반복하면 이론상으로 2의 n승배의 유전자가 증폭된다.

중합효소 연쇄 반응을 위하여 필요한 물질은 증폭하고자 하는 주형이 되는 DNA와 시발체, DNA 중합효소, dNTP, 완충액, 염화마그네슘(MgCl₂)이다. 주형이 되는 DNA로는 보통 20~100ng의 DNA를 사용하며, 시발체는 보통 20~30개의 염기로 이루어지도록 디자인하며 A, T와 G, C의 비율은 동일한 비로 이루어진 것이 좋다. 또한 G, C의 분포는 몰려 있지 않는 것을 사용하여야 한다. 또한 시발체 내와 시발체 간에 상보적인 염기 서열이 존재하지 않도록 하여야 한다. DNA 중합효소는 90℃ 이상의 고온에서도 활성을 잃지 않는 효소를 사용하며, DNA의 5’에서 3’으로 합성하는 기능, 3’에서 5’으로 잘못된 염기를 교정하는 능력을 가지고 있다. dNTP는 dATP, dCTP, dGTP, dTTP로 구성되며 보통 200 μM의 농도를 사용한다. 또한 DNA 중합효소가 작용하고 dNTP와 시발체가 결합하기 위하여 Mg²⁺가 필요하다. 완충액은 중합효소의 활성화를 위하여 필요하다.

중합효소 연쇄 반응의 변형 방법으로는, RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 역전사 반응을 시행하여 complementary DNA를 합성하여 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 시행하는 역전사중합효소 연쇄 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)과 형광물질을 사용하여 DNA를 증폭시키면서 증폭산물을 동시에 검출하는 실시간 중합효소 연쇄 반응 등이 있다.

[네이버 지식백과] 중합효소 연쇄 반응 [polymerase chain reaction] (서울대학교병원 의학정보, 서울대학교병원)

 

 

요약하자면 PCR 단계는 Denaturation, annealing, extension 의 3과정을 반복하게 된다.

 

Denaturation 과정에서 붙어있는 두 가닥의 DNA를 분리시키고

annealing 과정에서 온도를 낮추어 primer가 증폭되기를 원하는 서열 말단에 붙게하고

extension 과정에서 온도를 올려서 DNA를 합성하게 한다.

 

이 과정을 반복하면 DNA 는 2의 제곱 배로 수가 많아지게 된다.